反复种植失败患者行卵母细胞辅助激活技术后活产 1 例

患者 女，33岁，BMI 20.57 kg/m2 。因“婚后未避孕未孕 8+ 年”于 2017 年 5 月 10 日至温州医科大学附属第二医院、育英儿童医院就诊。患者平素月经周期规律（周期 25~30 d，经期 7 d），量中，偶有痛经。患者曾于 2015 年在国外因双侧输卵管阻塞行辅助生殖助孕共 3 周期，第 1周期获卵 8 枚，成胚 3 个，移植 1 次，未孕。第 2 周期获卵 2 枚，无胚胎形成。第3 周期获卵 8 枚，成胚 2 个，移植 1 次，未孕。

患者 2016 年外院输卵管造影示左侧输卵管阻塞，右侧输卵管通畅。男方2017 年 4 月精液常规检查基本正常，精子形态学检查提示重度畸形精子症，精子 DNA 碎片率（sperm DNA fragmentation index，DFI）为 19.3%。双方染色体核型 无殊。2017 年 4 月本院基础内分泌检查示：促黄体生成素（luteinizing hormone， LH）7.25 IU/L，卵泡刺激素（follicle-stimulating hormone，FSH）7.90 IU/L，泌 乳 素 11.27 ng/ml，孕 酮 0.75 ng/ml，雌 二 醇 45.93 pg/ml，睾酮0.51 ng/ml。患者于 2017 年 5 月开始第 1 周期，考虑其不孕主要原因为输卵管性，但患者有痛经，不能排除子宫内膜异位症引起不孕可能，本中心决定使用促性腺激素释放激素激动剂（gonadotropin-releasing hormone agonist，GnRH-a）全量降调节方案（GnRH-a 长方案）促排，获卵 10 枚，行体外受精（in vitro fertilization，IVF）后受精 2 枚，培育第 3 天（D3）胚胎 2 个，均于当月移植，未妊娠。第 2 周期中，为改善患者卵母细胞的成熟情况，本中心改用 高 孕 激 素 状 态 促 排 卵（progestinprimed ovarian stimulation，PPOS）方案促排，获卵7枚，IVF后受精4枚，培养D3胚 胎 4 个，冷冻 2 个第 4 天（D4）、2 个第 6 天 （D6）胚胎，当月未移植。第 3 周期，患者 移植 D6 冻融胚胎 2 个，未妊娠。第 4 周期中患者于移植前行宫腔镜下子宫内膜息肉摘除术，并且在激素替代治疗（hormone replace therapy，HRT）以 前 使 用 GnRH-a 预处理，即于月经期第 3 天注射 3.75 mg 醋酸曲普瑞林，28 d 后启动内膜准备，后移植 D4 冷冻胚胎 2 个，未妊娠。第 5 周期，患者使用 PPOS 方案促排，获卵 4 枚，行 IVF 后受精 2 枚，培育 D3 胚胎2 个，冷冻 D4 胚胎 2 个，当月未移植。第6 周期，患者移植 D4 冷冻胚胎 2 个，未妊娠，截止目前，加上先前国外的移植经历，患者共移植 6 次，累计移植胚胎数 12 个，均失败，补充诊断“反复种植失败（recurrent implantation failure，RIF）”。结合第 5 周期的卵母细胞及胚胎情况，发现 PPOS 促排虽可改善该患者的卵母细胞发育情况，但对患者的胚胎发育及移植结局并无明显增益。第 7 周期患者再次采用 GnRH-a 长方案促排，并采用卵胞浆内单精子注射（intracytoplasmic sperm injection，ICSI）受精，获卵10枚，受精3枚，培养 D3 胚胎 3 个，至第 5 天（D5）均无囊胚形成，当月无胚胎未移植。

患者于2019 年 6 月开始第 8 周期，使用 GnRH-a 长方案促排，获卵 12 枚，行卵母细胞辅助激活（artificial oocyte activation，AOA）后正常受精 9 枚，培养形成 D3 胚胎 9 个，其中 4 个 D3 胚胎为一级优胚（8A、8A、8B、8B），继续培养后，获得 D5 优质囊胚1 枚，考虑患者既往胚胎发育较慢，决定继续培育至第 7 天（D7），冷冻囊胚 2 个，当月移植D5胚胎1个后生化妊娠。患者于 2019 年 9 月开始第 9 周期，再次行宫腔镜下子宫内膜息肉摘除术，移植 D7 冷冻胚胎 2 个，后临床妊娠，于 2020 年 5 月（孕周39+4 ）剖宫产一子。周期总结：患者于本院共进行 5 次控制性卵巢刺激、2 次新鲜胚胎移植及 4 次冻融胚胎移植。患者前 4 次控制性卵巢刺激后行 IVF/ICSI 受精，移植后均未妊娠，于第 5 次控制性卵巢刺激后行 AOA，当月移植后生化妊娠，下一周期行冻融胚胎移植后获得活产结局。

讨论 当前国内外对 RIF 的定义未明确，现被广泛接受的 3 个定义如下：（1）移植 3 次及以上或移植高评分卵裂期胚胎数 4~6 个或高评分囊胚数 3 个及以上均失败；（2）3 次及以上高质量胚胎移植失败或移植胚胎数超过 10 个均失败；（3）2次及以上IVF/ICSI/冻融胚胎移植失败（移植高质量卵裂期胚胎超过 4 枚或高质量囊胚超过 2 枚）[1-3] 。无论哪种定义，该患者均符合。RIF 的病因主要包括：（1）胚胎因素：如精子质量、卵子质量等；（2）子宫因素：如子宫畸形，黏膜下及肌壁间子宫肌瘤、子宫内膜息肉等影响子宫内膜容受性的因素；（3）输卵管积水等[4] 。患者通过阴道超声、宫腔镜等方式排除了子宫因素和输卵管积水，结合冷冻移植周期中使用 GnRH-a 降调节预处理改善子宫内膜容受性及盆腔环境后，妊娠结局依然没有改变，考虑其 RIF 的病因以胚胎因素为主。男方虽为重度畸形精子症，DFI 为 19.3%，鉴于患者多次取卵后的成熟卵母细胞个数少，ICSI 后受精及胚胎发育情况未改善，考虑可能存在卵母细胞激活不足，因此决定以 AOA方式激活卵母细胞。 卵母细胞活化是细胞胞质 Ca2+ 浓度升高的过程。近年来，有大量研究表明卵母细胞激活涉及两步机制：Ca2+ 震荡功能启动和维持细胞活化。精子将磷脂酶Cζ 引入卵母细胞内，启动透明带反应来阻止多精子受精。数分钟内 Ca2+ 从内质网释放入胞内，后 Ca2+ 震荡持续存在于整个受精过程中，其幅度及频率随着受精过程的发展而不断降低，至原核形成时终止[5- 6] 。目前，AOA 较多应用在男性因素引起的 ICSI 受精失败患者，如圆头精子症。但有动物实验表明，错误的 Ca2+ 模式可能导致胚胎发育潜能受损，故 AOA 可能也适用于一些胚胎发育停滞、反复胚胎质量差甚至是 RIF 的不孕患者[7] 。该患者既往多次 COS 后虽能获得可用胚胎，但胚胎数量少、评分差，移植后均未妊娠，提示胚胎质量不佳，因此本中心决定行 AOA 以期提升胚胎质量，改善移植结局。

AOA 技术包括机械激活、电激活、化学激活三大类[8] 。本中心选择 Ca2+ 霉素——一种Ca2+ 通道激活体，进行化学激活，其基本原理即通过提高卵母细胞内Ca2+ 浓度，模拟受精时卵母细胞胞质 Ca2+的变化，从而促进卵母细胞激活。该患者行 AOA 后，受精率明显升高、D3 胚胎分级优化，当月移植后获得生化妊娠，下一周期行冻融胚胎移植后获得活产，与既往多次移植后未妊娠的结局对比，提示 AOA 明显改善了胚胎质量，最终获得满意的临床结局。

然而，利用Ca2+ 载体激活卵母细胞只会造成单次 Ca2+ 大量增加，而生理的受精过程中会出现多次 Ca2 + 振荡[9] ，因此AOA相关的安全性及伦理问题仍在讨论中。已有研究提示 AOA 用于人类生殖技术的可行性。Miller 等[10] 的一项回顾性队列研究显示在分别使用 ICSI 和 ICSI-Ca2+ 技术后，单胎和双胎妊娠中的出生缺陷率比较差异无统计学意义，此外，单胎或双胎妊娠的出生体重、分娩时孕周、胎儿性别比较差异均无统计学意义。

在最后一周期中，患者移植了 2 个D7 冷冻胚胎后妊娠。针对 D7 囊胚的移植，现存许多争议。过去认为，移植 D7囊胚的临床结局不佳，因此第 6 天未发育为囊胚的胚胎通常被丢弃。Su 等[11] 发现，63.3%的 D7 囊胚为非整倍体或染色体部分缺失，但整倍体的 D7 囊胚移植后依然可以获得活产。多项研究均提示，与 D5、D6 囊胚相比，移植 D7 囊胚的围生期指标、新生儿的出生情况及孕妇并发症的发生情况并无统计学差异。这说明尽管 D7 囊胚发育延迟，它依然可以拥有与 D5、D6 囊胚类似的发育潜能，最终发育为正常新生儿[12-15] 。

至于是否要将胚胎培育时间延长至 7 d，目前有多种声音：对于胚胎在 D6显示不清楚或早期囊胚发育的患者，可以将培育时间延长至 D7，防止在 D6 具有不典型或边缘形态的可存活囊胚被过早丢弃[15] ；对于未行胚胎植入前遗传学检测的延迟发育的囊胚可适当延迟培养时间，因为 D7 的囊胚发生非整倍体的可能性更高，使得胚胎发育时间延长[16] 。

本例患者既往周期中鲜有 D5、D6 囊胚，并且囊胚评分不高，结合其多次移植失败的经历，考虑存在胚胎发育延迟，本中心将胚胎培养延迟至 D7，最终获得活产的良好妊娠结局。因此在临床上对于无D5、D6 囊胚的患者，可以个体化考虑将培养周期延迟至 D7，以增加获得可用胚胎的数量。

本例患者最终足月妊娠，剖宫产一子，出生体重 2 350 g，为低体重出生儿。该新生儿的低出生体重是否与 AOA 技术的实施或 D7 囊胚移植有关，尚不能做出定论，本中心将继续跟踪该新生儿出生后的生长发育情况。有研究表明，实施 AOA 后出生的 3~10 岁儿童智力评估及运动能力评估结果平均值均在预期值内[17] ，初步证明AOA的安全性。 综 上 所 述 ，本 文 报 道 了 1 例 通 过 AOA 后移植 D7 囊胚后成功妊娠并抱婴回家的RIF患者，希望为RIF患者的治疗提供一些新的思路和启发，但 AOA 作为一项安全性尚未完全认证的新技术，在实施前仍需谨慎把握其适应证，做到因人制宜。