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PPOS 促排卵方案对颗粒细胞芳香化酶 CYP19A1 和 EＲβ 受体表达的自身对照研究
目前反复种植失败(repeated implantation fail-ure，RIF)是体外受精-胚胎移植(in-vitro fertiliza-tion embryo transplant，IVF-ET)中严重困扰医患双方的难题,其发生率约10%。目前国内外多数学者认为年龄<40岁,新鲜周期移植或冻胚移植(freeze-thaw embryo transfer,FET)3次及以上,至少移植4个优质胚胎而未获得妊娠者3次以上移植周期,每次移植1~2个优质胚胎仍未妊娠者为RIF。胚胎因素与子宫内膜的容受性是导致RIF的两个主要方面,胚胎质量差和发育潜能低下是导致RIF的主要原因之一,因此对RIF患者治疗应提高卵母细胞质量和数量,进而获得更多具有发育潜能的优质胚胎。IVF促排卵过程中大量促性腺激素的应用可能会影响胚胎质量。影响卵母细胞第一次减数分裂时微管和纺锤体的完整性，导致非整倍体卵母细胞、胚胎增加,进而导致胚胎种植失败和流产率升高。因此,针对RIF患者需要个体化、温和的促排卵方案，以改善卵母细胞质量,进而提高优质胚胞率。目前临床上促排卵方案较多，有促性腺激素释放激素(GnRH)激动剂方案、GnRH拮抗剂方案、温和刺激方案和卵泡期高孕激素状态下促排卵(PPOS)方案。但对RI患者再次促排卵哪种促排卵方案更合适?目前关于这方面的研究较少，结论也不统一。针对RI患者,在临床上再次促排方案的选择比较慎重,需要总结分析上次促排卵方案的效果,如何为RIF患者再次促排卵时选择合适且有效的促排卵方案,以提高RF患者的临床妊娠率,名个生殖中心医生面临的难题。本文探讨PPOS方案用于第一周期行长方案促排卵过程中黄体生成素(LH)偏低(扳机日LH<1.2mIU/mL)的RIF患者的临床效果，同时收集长方案和PPOS方案促排卵卵泡液中壁层颗粒细胞,检测颗粒细胞中芳香化酶CYPI9A1和ERβ受体的mRNA和蛋白质表达水平,以探讨不同促排卵方案对卵泡颗粒细胞发育的影响,以期为RIF患者再次促排卵时寻找一种可以改善卵子质量,进而提高RIF患者临床妊娠率的促排卵方案。
1.1一般资料
经南通大学附属妇幼保健院生殖医学伦理委员会批准[(2023)生殖伦理委员伦审第(15)号],并在患者知情同意下,对2020年1月至2022年1月在南通大学附属南通妇幼保健院生殖医学中心行IVF-ET的RIF患者进行研究,第1周期促排卵方案为黄体期减量长方案,新鲜周期移植以及冻胚移植均未获得临床妊娠,第2周期促排方案采用PPOS方案并行全胚冷冻的患者共36例。PPOS方案促排卵后2~3个月经周期后均采用人工周期行冻胚移植。本研究采用的BI诊断标准为:年龄<40岁,新鲜周期移植或T移植3次及以上或至少移植4个优质胚胎而未获得妊娠。
纳入标准:(1)年龄<35岁;(2)夫妻双方染色体均正常;(3)输卵管性不孕;(4)月经周期规律,28~35d,基础促卵泡生成素(FSH)<10U/L,基础窦卵泡数(AFC)≥6;(5)男方精液检查正常:(6)否认子宫内膜异位症病史:(7)宫腔镜检查无异常:(8)空腹血糖、空腹胰岛素、甲状腺等内分泌检测正常;(9)自身免疫性抗体阴性:抗核抗体，甲状腺抗体、抗磷脂抗体均阴性。
排除标准:(1)年龄≥40岁:(2)体质指数(BMI)≥28kg/m2；(3)多囊卵巢综合征(PCOS)输卵管积水、子宫内膜异位症、子宫腺肌病、黏膜下子宫肌瘤、子宫畸形;(4)复发性流产患者。第1周期促排卵采用垂体降调节长方案,第2周期改用PPOS方案促排卵,符合此标准的为36例。
1.2方法
1.2.1促排卵方案
(1)黄体期减量长方案:于口服短效避孕药第17天或自然周期监测排卵,排卵后7d予以醋酸曲普瑞林(Tntorelin,3.75mg/支,法国Ipsen公司)肌内注射0.93~1.25mg,14d后行阴道B超和性激素检查,判断是否达到垂体降调节标准当雌二醇(E2)<50pg/mL,LH<5IU/L,FSH<5IU/L,子宫内膜厚度≤5mm,卵巢内卵泡平均直径约5mm,且无功能性卵巢囊肿,则认为达到垂体降调节标准。当达到垂体降调节标准后，开始每天注射促性腺激素(Gn)。Gn为果纳芬(Gonal-F,75IU/支,瑞士Serono公司)或注射用尿促性素(HMG75IU/支,安徽省马鞍山丰原有限公司)。启动剂是主要根据患者的年龄、卵巢功能、手术史和BMI等综合判断,剂量范围为150~300IU。定期进行阴道B超检查监测卵泡发育,并根据卵泡发育情况和血性激素水平,适时调整促排卵药物剂量。(2)PPOS方案:于月经周期第2~3天开始口服醋酸甲羟孕酮片(MPA，2mg/片,浙江仙琚制药)4~6mg/d,同日开始注射C,定期B超监测卵泡发育情况,并结合性激素水平适时调整Gn用量,直至HCG注射日.减量长方案和PPOS的扳机标准都为:如果主导卵泡平均直径有1个≥18mm或2个≥17mm时,停用Gn,结合血E2水平,判断是否符合扳机标准时,于当天晚上予以人绒毛膜促性腺激素(HCC)6000~1000IU肌内注射。
1.2.2取卵、体外受精
当HCG肌内注射后36-37h后,在阴道B超引导下行取卵术,常规进行体外受精与胚胎培养操作。体外受精后72h(D3)时进行新鲜周期胚胎移植或全胚冷冻。PPOS方案全部全胚冷冻。
1.2.3冻胚移植方案
冻胚移植方案为人工周期方案,从月经周期第3天开始口服雌二醇/雌二醇地屈孕酮片(红片)(Femoston,2/10mg/粒,美国Abbott公司)4~8mg/d,当阴道B超检査子宫内膜≥8mm,雌二醇≥250pg/mL,子黄体酮软胶囊(Utrogestan,0.1g/粒,法国Besins公司)和雌二醇/地屈孕酮片(黄片)行内膜转化,每周期移植优质胚胎数不超过2枚。胚胎移植后行黄体支持,黄体支持药物为黄体酮软胶囊和雌二醇/地屈孕酮片(黄片)。在胚胎移植术后14d,行血HCG检查确定是否妊娠,。胚胎移植后28d行经阴道B超检查,宫内见孕囊见胚芽及原始心管搏动则诊断为临床妊娠。
1.2.4颗粒细胞的收集
由胚胎实验室医师检出直径为16~20mm卵泡的卵泡液中卵丘复合物后，用50mL离心管分别收集每例患者剩余的卵泡液收集好的卵泡液于1000r/min离心10min,弃上清,分离卵泡液中的颗粒细胞。用淋巴细胞裂解液去除白细胞,以2000r/min离心20min,收集细胞沉淀。用1mLPBs重悬颗粒细胞沉淀,4℃以1000r/min离心5min,收集颗粒细胞沉淀,冻存于-80℃冰箱。
1.2.5RT-PCR检测颗粒细胞中芳香化化酶CYPI9AI和ERβ受体在mRNA水平的表达
TRIzol法提取颗粒细胞总RNA，用分光光度计检测其0D..10D…比值,使其0D..10D…比值在1.8~2.0之间。根据逆转录试剂盒的操作说明书将其反转录成cDNA,采用Pnmerpremier5.0软件设计引物,用B-actin作为内参基因,引物序列如下:CYP19A1-F:5'-CAGACCCCAAGAGTTTGAGG-3:CYPI9A1R:5'-ACACTACCACCTCCCTTTGG-3:ERB-F:5'-ATACATACCTTCCTCCTAT-3:ERB-R:5'TTCCAAGTTAGTCACATT-3:GAPDH-F:5'ACCACAGTCCATCCCATCAC-3:GAPDH-R:5'TCCACCACCCTCTTGCTG-3':采用SYBRGreen法进行qPCR,用2-^~法计算各基因表达的相对表达量。
1.2.6Westernblot检测颗粒细胞中芳香化酶CYPI9Al和ERB受体在蛋白水平的表达
取解冻后的颗粒细胞沉淀经RIPA裂解提取总蛋自，用BCA试剂盒检测蛋白浓度,取20g总蛋白在10%SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白,然后转膜、封闭，后加入用1:1000CYP19A1和ERB单克隆抗体5.0mL后4℃孵育过夜:洗膜后再加入相对应的二抗:再次洗膜后用数码凝胶图像分析系统拍照，并测定灰密度值。以GAPDH作内参，CYPI9Al和ERβ的表达量用CYP19A1和ERβGAPDH的灰密度值的比值来表示。
1.2.7观察指标
记录观察两组患者的获卵数、MⅡ卵母细胞数、正常受精率和优质胚胎率。比较两组患者颗粒细胞中芳香化酶CYP19A1和ERB受体的mRNA和蛋白表达水平。
1.3统计学方法
采用SPSS20.0统计软件进行数据处理和统计分析，计量资料用均数土标准差(x±s)表示,计数资料采用百分数(%)或例数表示。计量资料如果符合正态分布和方差齐性，采用独立样本，检验进行两组间比较，如果不符合正态分布的资料,则采用U检验进行两组间比较。计数资料采用x检验或sher确切概率法,以上统计结果以P<0.05表示差异有统计学意义。
2.1患者一般情况比较
本研究共纳入PPOS方案组和长方案组各36例,两组患者的年龄、不孕年限、BMI、基础FSH、IH、E，以及AFC的比较差异均无统计学意义(P>0.05)。见表1。
2.2PPOS方案组与长方案组获卵及胚胎发育情况的比较
PPOS方案和长方案平均获卵数、成熟卵母细胞数的比较差异无统计学意义(P>0.05)。而PPOS方案的扳机日IH水平、正常受精(2PN)数、正常受精率、优质胚胎率显著高于长方案(P<0.05)。见表2。
2.3 qPCR检测颗粒细胞中CYP19A1和ERB受体mRNA水平的表达
qPCR方法检测了PPOS方案组和长方案组颗粒细胞中CYPI9A1和ERβ受体的mRNA表达水平,PPOS组中CYP19A1和ERβ受体的mRNA表达水平均高于对照组,差异有统计学意义(P<0.001)。见图1。
2.4 Westem blot检测颗粒细胞中CYP19A1和ERB受体蛋白水平的表达
Western blot检测了促排卵方案对颗粒细胞中CYP19A1和ERβ受体蛋白水平水平的影响,与mRNA表达水平结果相一致,PPOS组中CYPI9A1和ERβ受体的蛋白表达水平均高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。见图2。
颗粒细胞与卵母细胞之间关系密切,细胞间存在缝隙连接,依靠连接蛋白细胞间相互交换信息、相互促进、同步发育。颗粒细胞还以内分泌的方式对卵母细胞的成熟起作用,影响受精甚至胚胎的发育潜能。因此颗粒细胞的功能状态与卵子成熟、受精以及胚胎质量密切相关。壁颗粒细胞排列在卵泡上,紧邻卵泡膜细胞及血管,生成类固醇激素活性最强,在排卵前,表达最丰富的LH受体。
LH是一种由垂体分泌的糖蛋白激素,在雌激素合成、卵泡发育及诱发排卵等方面都发挥着重要的作用。LH是影响胚胎质量的重要因素,LH的下降会导致卵泡液中的VECF也出现下降,影响卵泡生长发育所需的血供,使纺锤体的结构发生改变，染色体发生异常,进而影响卵母细胞的质量,导致胚胎发育障碍。
卵母细胞的发育与成熟、减数分裂的完成均需要将LH维持在适宜的水平,LH可激活参与卵母细胞减数分裂的MAPK和EGF信号通路四。Balasch等2002年提出了“LH阈值窗理论”,卵泡的正常发育需要最低水平的IH维持,若低于此阈值会影响卵泡发育和成熟。目前国内外对扳机日IH水平的最低界值尚未完全统一,有学者认为扳机日LH>1.2IU/L,时临床妊娠率较好。
GnRH-a垂体降调节方案是经典的促排卵方案,卵泡发育的同步性和胚胎种植的子宫内膜容受性都较好,鲜胚移植的成功率较高,是目前卵巢功能正常患者的标准促排卵方案,但因患者的个体性差异,对GnRH-a的反应不同,部分患者会出现垂体抑制过深/过度抑制,导致LH水平较低,卵巢的反应性下降,卵泡的发育和成熟受到障碍,进而影响卵子质量和胚胎质量。
雌激素是卵泡期颗粒细胞分泌的主要甾体激素,CYP19A1基因编码的芳香化酶是颗粒细胞中雌激素合成的关键酶,敲除CYPI9A1基因的小鼠不能产生雌激素导致不孕,敲除CYPI9A1基因的小鼠卵巢中的卵泡形态也出现异常,但当给予外源性雌激素后可恢复卵泡形态。雌激素由与颗粒细胞上的雌激素受体(estrogenreceptor，ER)结合后促进颗粒细胞的增殖与分化,抑制其凋亡,从而避免卵泡的闭锁。在卵巢中主要表达ERβ受体,ERβ受体在促进卵泡生长、抑制卵泡闭锁以及促性腺激素诱导的颗粒细胞分化中起重要作用。因此检测颗粒细胞中CYPI9A1基因及ERβ的表达水平可以了解不同促排卵方案对卵泡发育情况的影响以及间接推断卵子的质量。
本研究发现在第1周期行长方案促排卵过程中LH偏低的RIF患者中,第2周期改用PPOS方案组后,扳机日的LH水平明显上升,同时壁层颗粒细胞ERβ mRNA水平和蛋白水平均显著高于长方案组，CYPI9A1 mRNA水平和蛋白水平均也显著高于长方案组,说明改用PPOS方案后,LH水平有所提高,改善了患者的卵子质量,进而提高了胚胎质量。由于本研究为回顾性自身对照研究，且样本量有限，需进一步进行大样本多中心的随机对照研究，进一步研究探讨PPOS方案在反复种植失败患者的临床应用价值。
